字體:小 中 大 | |
|
|
2007/04/20 02:26:19瀏覽9010|回應0|推薦0 | |
材料 燈箱、染色盒、福馬林、磷酸氫鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、絕對酒精、冰醋酸、Alcian Blue 8GX/8GN粉末、氫氧化鉀、過氧化氫(3%)、硼沙(Na2B4O7•10H2O)、胰蛋白脢(trypsin)、Alizarin Red S粉末、甘油、麋香草酚結晶(thymol, C10H14O)、水合氯醛(chloral hydrate, C2H3Cl3O2)、二甲苯(xylene) 溶液備製 1、Alcian Blue染劑 溶劑:40份冰醋酸及60份絕對酒精(或20份冰醋酸及80份的95%酒精) 每100ml溶劑中溶入0.01g-0.03g Alcian Blue粉末 註1:若ph值低於1或高於3、或溶液產生強烈的酯味時,即不可再用。 註2:此溶液可重複使用,需放入冰箱冷藏。 2、2% KOH 3、飽和硼砂溶液 將過量的硼砂加入一公升或更多的蒸餾水中,攪拌均勻,讓過多的粉末沉澱後,使用上清液。 4、Alizarin Red S 溶液 a. 將過量的Alizarin Red S粉末溶於15ml的50%冰醋酸中(使飽合) b. 30ml甘油 c. 180ml的1% chloral hydrate(1.8g chloral hydrate溶於180ml蒸餾水) 將a、b、c三者混合均勻,以褐色瓶保存。 5、Trypsin溶劑 30份飽合硼砂溶液加70份蒸餾水 方法 1、固定 可用中性福馬林或95%酒精,固定一週以上時間,每兩天換一次酒精(或先以福馬林固定30~60分,再以95%酒精固定一週)。 2、清洗 (1) 福馬林固定標本以水清洗1~2天,酒精固定標本可以不必清洗。 (2) 記錄標本的:a、性別;b、標準長或其他型質;c、發育階段(幼體或成體或亞成體) (3) 將標本剝去表皮或去鱗(魚類),摘除內臟,將表皮及內臟編號另以容器保存。大塊的肌肉必須拿掉。輕輕割開薄層肌肉,避免傷及軟骨和其他骨骼,以便於染劑與其他溶液滲入。此外,含多量色素的區域,如眼球等也應該拿掉。 3、 脫水(染色準備) 將標本依70%酒精 → 95%酒精 → 絕對酒精I → 絕對酒精Ⅱ之順序脫水,每一步驟至少24hr。 4、去脂(非必要步驟) 將標本以二甲苯除去脂肪,時間和換藥次數視標本大小而定。 5、Alcian blue染色 標本由絕對酒精或二甲苯(如果有進行去脂步驟 )移入Alician blue溶液中,3~5cm大小的標本染色時間在3~5hr。標本須完全浸入染劑中,判定染色程度可將標本由染劑中取出,置於解剖顯微鏡下觀察,最外層軟骨(如指骨或趾骨尖端、胸骨、肋骨末稍)若呈藍色表示已染上顏色。由於後續步驟會造成些許褪色,因此染深一點可能會有較好的效果。儘可能採高濃度,短時間的染色方式. 6、中和(neutralization) 將染好的標本置入飽和硼砂溶液中,溶液體積約為標本大小的50倍。浸入硼砂中24小時後,換新鮮硼砂溶液,再經24hr,即可進行下一步驟。 注意:如果染色過程須要中斷,可在此步驟完成後,以70%酒精保存標本。一旦開始進行下一步驟,就必須作完全流程。中斷後再進行時,需由步驟2開始。 7、透明(clearing) 將標本置於酵素溶劑中,其體積為標本大小的10~20倍。隨後加入約0.45g(1/4茶匙)的trypsin,混合均勻。但勿攪拌。將標本置於溫暖處,最好是光源附近。每2~4天溶液變黃及混濁,是正常的狀況。大約一週更換一次酵素溶劑及trypsin,直到標本的骨骼在關節處,開始呈現鬆弛的程度,可移至下一步。(可將標本及溶液在夜間放入冷藏庫,以減緩作用時間) 8、漱洗(rinsing) 將標本移入0.5%KOH溶液中漱洗,去除殘餘酵素。 9、Alizarin Red S 染色 先將5ml Alizarin Red溶液液與2%KOH溶液混和,再將標本浸入此一混合染劑中至骨骼呈色。如有需要,也可使用較多量的Alizarin Red,但可能造成染色過度。 注意:若標本很小或已開始分離,最好是降低KOH濃度到1%或0.5%。 10、 甘油保存 標本經雙重染色,先用0.5%KOH漱洗,再置入一序列的甘油--2%KOH混合液或甘油--65%酒精混合液中。若標本較大或有未透明的肌肉組織,最好以甘油--KOH混合液處理;若標本太小或有解體可能,則以「甘油-65%酒精」混合液處理為佳。 混合液序列: (1)甘油:KOH(or酒精) = 3:7(體積比) (2)甘油:KOH(or酒精) = 7:3(體積比) (3)100% 甘油 (4)100% 甘油 序列中每一步驟 【(1)~(4)】需時2天以上。最後透明骨骼標本保存在100%甘油中,同時添加數粒thymol結晶,避免黴菌滋生。 參考文獻 Dingerkus, G. and L. D. Uhler 1977. Enzyme clearing of alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage. Stain Tech. 52(4):229-232. Wassersug, R. D.1976. A procedure for defferential staining of cartilage and bone in whole formalin-fixed vertebrates. Stain Tech.51(2):131-134.
|
|
( 知識學習|科學百科 ) |