材料

燈箱、染色盒、福馬林、磷酸氫鈉（Na₂HPO₄）、磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄）、絕對酒精、冰醋酸、Alcian Blue 8GX/8GN粉末、氫氧化鉀、過氧化氫（3%）、硼沙（Na₂B₄O₇•10H₂O）、胰蛋白脢（trypsin）、Alizarin Red S粉末、甘油、麋香草酚結晶（thymol, C₁₀H₁₄O）、水合氯醛（chloral hydrate, C₂H₃Cl₃O₂）、二甲苯（xylene）

溶液備製

1、Alcian Blue染劑

溶劑：40份冰醋酸及60份絕對酒精（或20份冰醋酸及80份的95%酒精）

每100ml溶劑中溶入0.01g-0.03g Alcian Blue粉末

註1：若ph值低於1或高於3、或溶液產生強烈的酯味時，即不可再用。

註2：此溶液可重複使用，需放入冰箱冷藏。

2、2% KOH

3、飽和硼砂溶液

將過量的硼砂加入一公升或更多的蒸餾水中，攪拌均勻，讓過多的粉末沉澱後，使用上清液。

4、Alizarin Red S 溶液

a. 將過量的Alizarin Red S粉末溶於15ml的50%冰醋酸中（使飽合）

b. 30ml甘油

c. 180ml的1% chloral hydrate（1.8g chloral hydrate溶於180ml蒸餾水）

將a、b、c三者混合均勻，以褐色瓶保存。

5、Trypsin溶劑

30份飽合硼砂溶液加70份蒸餾水

方法

1、固定

可用中性福馬林或95%酒精，固定一週以上時間，每兩天換一次酒精（或先以福馬林固定30~60分，再以95%酒精固定一週）。

2、清洗

(1) 福馬林固定標本以水清洗1~2天，酒精固定標本可以不必清洗。

(2) 記錄標本的：a、性別；b、標準長或其他型質；c、發育階段（幼體或成體或亞成體）

(3) 將標本剝去表皮或去鱗（魚類），摘除內臟，將表皮及內臟編號另以容器保存。大塊的肌肉必須拿掉。輕輕割開薄層肌肉，避免傷及軟骨和其他骨骼，以便於染劑與其他溶液滲入。此外，含多量色素的區域，如眼球等也應該拿掉。

3、 脫水（染色準備）

將標本依70%酒精 → 95%酒精 → 絕對酒精I → 絕對酒精Ⅱ之順序脫水，每一步驟至少24hr。

4、去脂（非必要步驟）

將標本以二甲苯除去脂肪，時間和換藥次數視標本大小而定。

5、Alcian blue染色

標本由絕對酒精或二甲苯（如果有進行去脂步驟 ）移入Alician blue溶液中，3~5cm大小的標本染色時間在3~5hr。標本須完全浸入染劑中，判定染色程度可將標本由染劑中取出，置於解剖顯微鏡下觀察，最外層軟骨（如指骨或趾骨尖端、胸骨、肋骨末稍）若呈藍色表示已染上顏色。由於後續步驟會造成些許褪色，因此染深一點可能會有較好的效果。儘可能採高濃度，短時間的染色方式.

6、中和（neutralization）

將染好的標本置入飽和硼砂溶液中，溶液體積約為標本大小的50倍。浸入硼砂中24小時後，換新鮮硼砂溶液，再經24hr，即可進行下一步驟。

注意：如果染色過程須要中斷，可在此步驟完成後，以70%酒精保存標本。一旦開始進行下一步驟，就必須作完全流程。中斷後再進行時，需由步驟2開始。

7、透明（clearing）

將標本置於酵素溶劑中，其體積為標本大小的10~20倍。隨後加入約0.45g（1/4茶匙）的trypsin，混合均勻。但勿攪拌。將標本置於溫暖處，最好是光源附近。每2~4天溶液變黃及混濁，是正常的狀況。大約一週更換一次酵素溶劑及trypsin，直到標本的骨骼在關節處，開始呈現鬆弛的程度，可移至下一步。（可將標本及溶液在夜間放入冷藏庫，以減緩作用時間）

8、漱洗（rinsing）

將標本移入0.5%KOH溶液中漱洗，去除殘餘酵素。

9、Alizarin Red S 染色

先將5ml Alizarin Red溶液液與2%KOH溶液混和，再將標本浸入此一混合染劑中至骨骼呈色。如有需要，也可使用較多量的Alizarin Red，但可能造成染色過度。

注意：若標本很小或已開始分離，最好是降低KOH濃度到1%或0.5%。

10、 甘油保存

標本經雙重染色，先用0.5%KOH漱洗，再置入一序列的甘油--2%KOH混合液或甘油--65%酒精混合液中。若標本較大或有未透明的肌肉組織，最好以甘油--KOH混合液處理；若標本太小或有解體可能，則以「甘油－65%酒精」混合液處理為佳。

混合液序列：

(1)甘油：KOH（or酒精） = 3：7（體積比）

(2)甘油：KOH（or酒精） = 7：3（體積比）

(3)100% 甘油

(4)100% 甘油

序列中每一步驟 【（1）~（4）】需時2天以上。最後透明骨骼標本保存在100%甘油中，同時添加數粒thymol結晶，避免黴菌滋生。

參考文獻

Dingerkus, G. and L. D. Uhler 1977. Enzyme clearing of alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage. Stain Tech. 52(4):229-232.

Wassersug, R. D.1976. A procedure for defferential staining of cartilage and bone in whole formalin-fixed vertebrates. Stain Tech.51(2):131-134.