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製作(單色、雙重)染色的透明骨骼標本
2007/04/20 02:26:19瀏覽9010|回應0|推薦0

材料

燈箱、染色盒、福馬林、磷酸氫鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、絕對酒精、冰醋酸Alcian Blue 8GX/8GN粉末、氫氧化鉀、過氧化氫(3%)、硼沙(Na2B4O710H2O)、胰蛋白脢(trypsinAlizarin Red S粉末、甘油、麋香草酚結晶(thymol, C10H14O)、水合氯醛(chloral hydrate, C2H3Cl3O2)、二甲苯(xylene

溶液備製

1Alcian Blue染劑

溶劑:40份冰醋酸及60份絕對酒精(或20份冰醋酸及80份的95%酒精)

100ml溶劑中溶入0.01g-0.03g Alcian Blue粉末

1:若ph值低於1或高於3、或溶液產生強烈的酯味時,即不可再用。

2:此溶液可重複使用,需放入冰箱冷藏。

22% KOH

3、飽和硼砂溶液

將過量的硼砂加入一公升或更多的蒸餾水中,攪拌均勻,讓過多的粉末沉澱後,使用上清液。

4Alizarin Red S 溶液

a. 將過量的Alizarin Red S粉末溶於15ml50%冰醋酸中(使飽合)

b. 30ml甘油

c. 180ml1% chloral hydrate1.8g chloral hydrate溶於180ml蒸餾水)

abc三者混合均勻,以褐色瓶保存。

5Trypsin溶劑

30份飽合硼砂溶液加70份蒸餾水

方法

1、固定

可用中性福馬林或95%酒精,固定一週以上時間,每兩天換一次酒精(或先以福馬林固定30~60分,再以95%酒精固定一週)。

2、清洗

(1) 福馬林固定標本以水清洗1~2天,酒精固定標本可以不必清洗。

(2) 記錄標本的:a、性別;b、標準長或其他型質;c、發育階段(幼體或成體或亞成體)

(3) 將標本剝去表皮或去鱗(魚類),摘除內臟,將表皮及內臟編號另以容器保存。大塊的肌肉必須拿掉。輕輕割開薄層肌肉,避免傷及軟骨和其他骨骼,以便於染劑與其他溶液滲入。此外,含多量色素的區域,如眼球等也應該拿掉。

3 脫水(染色準備)

將標本依70%酒精 95%酒精 絕對酒精I 絕對酒精Ⅱ之順序脫水,每一步驟至少24hr

4、去脂(非必要步驟)

將標本以二甲苯除去脂肪,時間和換藥次數視標本大小而定。

5Alcian blue染色

標本由絕對酒精或二甲苯(如果有進行去脂步驟 )移入Alician blue溶液中,3~5cm大小的標本染色時間在3~5hr。標本須完全浸入染劑中,判定染色程度可將標本由染劑中取出,置於解剖顯微鏡下觀察,最外層軟骨(如指骨或趾骨尖端、胸骨、肋骨末稍)若呈藍色表示已染上顏色。由於後續步驟會造成些許褪色,因此染深一點可能會有較好的效果。儘可能採高濃度,短時間的染色方式.

6、中和(neutralization

將染好的標本置入飽和硼砂溶液中,溶液體積約為標本大小的50倍。浸入硼砂中24小時後,換新鮮硼砂溶液,再經24hr,即可進行下一步驟。

注意:如果染色過程須要中斷,可在此步驟完成後,以70%酒精保存標本。一旦開始進行下一步驟,就必須作完全流程。中斷後再進行時,需由步驟2開始。

7、透明(clearing

將標本置於酵素溶劑中,其體積為標本大小的10~20倍。隨後加入約0.45g1/4茶匙)的trypsin,混合均勻。但勿攪拌。將標本置於溫暖處,最好是光源附近。每2~4天溶液變黃及混濁,是正常的狀況。大約一週更換一次酵素溶劑及trypsin,直到標本的骨骼在關節處,開始呈現鬆弛的程度,可移至下一步。(可將標本及溶液在夜間放入冷藏庫,以減緩作用時間)

8、漱洗(rinsing

將標本移入0.5%KOH溶液中漱洗,去除殘餘酵素。

9Alizarin Red S 染色

先將5ml Alizarin Red溶液液與2%KOH溶液混和,再將標本浸入此一混合染劑中至骨骼呈色。如有需要,也可使用較多量的Alizarin Red,但可能造成染色過度。

注意:若標本很小或已開始分離,最好是降低KOH濃度到1%0.5%

10 甘油保存

標本經雙重染色,先用0.5%KOH漱洗,再置入一序列的甘油--2%KOH混合液或甘油--65%酒精混合液中。若標本較大或有未透明的肌肉組織,最好以甘油--KOH混合液處理;若標本太小或有解體可能,則以「甘油-65%酒精」混合液處理為佳。

混合液序列:

(1)甘油:KOHor酒精) = 37(體積比)

(2)甘油:KOHor酒精) = 73(體積比)

(3)100% 甘油

(4)100% 甘油

序列中每一步驟 【(1~4)】需時2天以上。最後透明骨骼標本保存在100%甘油中,同時添加數粒thymol結晶,避免黴菌滋生。

參考文獻

Dingerkus, G. and L. D. Uhler 1977. Enzyme clearing of alcian blue stained whole small vertebrates for demonstration of cartilage. Stain Tech. 52(4):229-232.

Wassersug, R. D.1976. A procedure for defferential staining of cartilage and bone in whole formalin-fixed vertebrates. Stain Tech.51(2):131-134.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

( 知識學習科學百科 )
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引用
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