老白龙马对网友生物制品细胞培养污染问题咨询的答复

sx:你好

     我们生物研究所的上一辈病毒专家活下来的多已八,九十岁了,七十多的也"颐养天年"了,我虽然是上个世纪五十年代的"老病毒",但半个世纪病毒的飞速发展,观点早已落伍了.何况自己早已经脱离了生物制品病毒工作.从时间上讲,我从事卡介苗,炭疽时间最久.

      污染是生物制品生产工作最常见,最棘手,最复杂,最难解决的大难题,大罐培养经常是整罐疫苗辛辛苦苦培养,最后倒掉!

     从病毒细胞培养来看,无非是要注意传代细胞和毒种本身检查,是否已经污染;外部环境,器皿,用具,培养基,工作人员操作....

     细胞经常会伴有共生微生物的,有的是有益的,不防碍细胞的生长和传代;有的是有害的,有的是在培养的不同阶段,不同条件下才表现出污染生物的生长优势;这就要靠工作经验,对污染进行分析,判断,排查,鉴别.

污染原因:是全部培养瓶还是局部;是毒种还是细胞;是培养基还是容器;是人员操作还是环境?

污染原是什么?是病毒,细菌,真菌,霉菌,支原体,衣原体......

    然后,根据具体情况再去细分,再探察,寻找,定位真正"元凶",有时候真的只能是不了了之!只能是知道污染了,从头再来!我们只能在污染和去污染之间进行取舍,因为搞清楚这真正污染微生物太难了,或者干脆就判断是细菌,霉菌,只能到此打住.详细的微生物鉴别,分类还有待我们事业的不断发展,或是以后解决的事情吧?

     例如西方疫苗携带"疯牛病病毒"污染,传播问题,它是在疫苗培养中加入牛血清造成的,并且目前条件和技术还检查不出来.那么,还有多少我们目前不知道的,目前不能解决的微生物污染问题?!

    总之,生物制品生产要求是安全,有效.并且安全是第一位的.所以,解决制品的污染问题是我们生物制品生产和研究人员天天,时时刻刻必须面对的难题.

好了,罗嗦这许多,提供你参考吧,祝你工作顺利,身体健康!

                              老白龙马   07-6-15
 

在07-6-14，zsx写道：

L老师：

    你好！从您的BLOG上知道您是从事生物医学方面的行家了，我是在长春从事生物制品工作的一个年轻人，现在有一个问题想向您请教，在我的工作过程中，有一种未知的污染物污染了我所培养的细胞，过去曾培养的CHO细胞（中华仓鼠卵巢细胞）就受到了这种污染物的污染，表现症状为在致密的细胞间出现"裂缝"，即细胞脱落，在转瓶内腔表面形成空隙，培养液表面有大片似"油膜"状的物质，定期连续换液，更新培养基一段时间后，细胞大量死亡脱落，最严重的时候，细胞传代后不贴壁既已全部死亡，做过电镜检查，镜下有黑色小虫样儿物质快速移动，据此，开始怀疑是支原体污染，故每次更新DMEM培养液同时，使用大剂量卡那霉素（10X或20X常规卡那霉素使用量 ）冲击，连续冲击5～6次，即可控制住该污染。

    最近，我培养VERO（非洲绿猴肾细胞），亦出现该症状，但不同的是，在MEM培养液中同时又出现了白色肉眼可见的小块儿漂浮物，瓶壁上又有聚团的物质，细胞贴壁情况不好，密度也上不去，细胞出现裂缝，培养液表面也有大片"油膜"状物质，晃动后，该"油膜"状物质可以挂在瓶壁表面上，慢慢滑落，根据"白色肉眼可见的小块儿漂浮物"我又怀疑是真菌污染，但真菌对卡那霉素有耐药性，又和前面的冲击办法相矛盾，唉～

    从细胞间出现裂缝及油膜状物质的出现，基本可以排除污染物不同的情况～到底会是什么呢？

    望您能给我指点一下迷津 ，谢谢～

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^_^，谢谢老白龙马的回复，咱俩还属于一个单位呢~^o^~，只不过我是长春的啊～对于污染的问题，我今天在镜下污染细胞进行了拍照，仔细的对比分析，真菌污染的可能性偏大，而以前培养的细胞，支原体污染的可能性比较大~不论是什么污染，选择 一种积极的处理办法总是对的，于是，今天下午去弄了些泰乐菌素，明天再去弄点儿两性霉素B，将细胞分成三组，头两组分别加入泰乐菌素及两性霉素B，第三组使用两种药物进行混合处理，以用来对抗支原体及真菌，不指望能将细胞彻底的能挽救回来，只是为了增长一下自己的经验，看看三组细胞在进行了上述处理后会有如何的变化～然后再进一步的采取措施～总之，上述两种污染都是比较棘手的问题，支原体清除的可能性基本没有，就连美国的ATCC都承认自己保藏的细胞株有15％被支原体污染，并且不可消除，即便如此，ATCC却已经是这个地球上污染率最低的微生物（包含细胞、菌株及病毒株）保藏中心了，其他发达国家微生物保藏中心的支原体污染率也在30～60％之间，而中国，据传已达到了95％的污染率-_-!!!，虽然这个数字没有经过官方的证实，均是民间组织的调查结果，但也不能不说明些问题啊，近两年来，国家对小牛血清的生产厂家也进行了严管及监控，希望这些措施为时不晚啊～另外，据说国外生产的一种名为四环素与截短侧耳素的复合物(BM-cyclin)东西对付支原体比较奏效，但似乎不适合于大规模细胞培养～真菌相对于支原体来说，还好对付些，有柳硫汞、紫外照射、抗生素类药物、干热灭菌等许多防治办法，但它的芽孢也是很厉害的啊，有如家居里面的蟑螂，芽孢在环境恶劣条件下，它就休眠，看似控制住的污染再不经意间就会死灰复燃～好啦，不磨磨叽叽的了，这次到这里哈～下次我咨询一下卡介苗方面的问题，嚯嚯～据说这个是老白龙马的强项啊～^_^,这次到这里～再次感谢哈～