1925年3月20日，孫中山因病不幸在北京去世，因其生前遺言希望葬于南京，故暫時停靈於北京香山。

1926年6月，蔣介石率領國民革命軍揮師北伐。1927年3月23日，北伐軍光復南京；4月18日，國民政府宣佈定都南京。蔣介石於同日發表講話，闡述其在南京建立國民政府的原因：“中華民族歷史上兩次被外來民族所霸佔，而皆終結于南京，大明定都南京推翻蒙古，民國建都南京推翻滿清；先總理曾說北京象徵專制，南京象徵民主與自由，先總理選定南京做為我們的國都，我們負有重大責任，保衛並服務於我們的政府，直至生命最後一息”。

（蔣先生發表之定都聲明何等慷慨激昂，然其生命之最後一息並不在南京。蔣氏是否一苟且偷生之人，筆者不敢妄言，然自西安事變，蔣氏由反共驟而聯共；1948年底，早早經營台灣，以為後路。有此二事，歷史終將對其有所結論。）

國民政府定都南京後，開始了將南京建設為世界一流城市的「首都計畫」，聘請美國建築設計師亨利墨菲為總顧問，同時強調“發揚光大固有之民族文化”，為南京城留下了眾多民國風格濃郁的偉大建築。當時建築的綜合品質、安全性能已被公認遠勝於今日的建築物，雖然現今號稱科技水準領先民國時期70年，却只是莫大的諷刺劇。

孫中山評價南京：「南京為中國古都，在北京之前，而其位置乃在一美善之地區，其地有高山，有深水，有平原，此三種天工，鐘毓一處，在世界之大都市誠難覓此佳境也」。

1929年5月28日，孫中山靈柩奉安于南京中山陵。此前，蔣宋美齡選定法式梧桐為南京的行道樹，奠定了南京處處為林蔭大道的獨特城市風格。1949年4月南京淪陷後，當局大肆砍伐樹木，截至目前，孫中山「奉安大典」時栽種的兩萬棵梧桐已僅剩3千棵。當局的倒行逆施，激起了南京市民及海內外同胞的一致譴責。

南京十年

自1927年4月國民政府定都南京始，至1937年11月全面抗戰爆發，國民政府宣佈遷都重慶，這十年間中華民國工業總產值年平均增長7.7%，與當時世界範圍的經濟大蕭條形成極大反差，鋼鐵工業、飛機製造業、電工電料業、化學工業、礦產業等一批新興行業蓬勃發展，部分國貨產品的品質已完全取代進口產品。因此這十年被史學界稱為「南京十年」，又稱「黃金十年」。

「南京十年」時期，國民政府成功發行全國統一的紙幣—法幣，完善了十進位制的貨幣制度，結束了數千年來中國使用黃金、白銀進行商品結算的歷史，使中國向現代金融體系轉型。

而在稅收方面，國民政府積極與東西方列強談判收回關稅自主權，在國內徹底取消「厘金」（即現在的過路過橋費），當時中國國內人流、物流暢通無阻。

「南京十年」時期，國內雖面臨共產黨的不斷叛亂破壞，外有日寇之侵略，國民政府仍建設鐵路5400公里，其中隴海線、平漢線、粵漢線、浙贛線、廣九線直至今日仍是中國鐵路的動脈；公路方面，修建公路總裏長達43,521 公里。

在這一時期，國民政府頒佈了十四年制義務教育大綱，大力投資建設教育事業，在文化藝術界造就了胡適、翁文灝、鄒韜奮、陶行知、傅斯年、張愛玲、沈從文、曹禺、梅蘭芳、顧頡剛、徐悲鴻、黃炎培、林徽音、梁思成、陳寅恪、林語堂、馮友蘭、齊白石、錢鍾書、楊絳、巴金、費孝通、傅抱石、魯迅等一大批璀璨奪目的文化大師，他們的成就與光輝是今日的犬儒們無法企及的。